微量样本总RNA提取试剂盒

产品货号：

WH0059

中文名称：

微量样本总RNA提取试剂盒

英文名称：

Total RNA Extraction Kit

产品规格：

50次

发货周期：

1～3天

产品价格：

询价

本制品可以从微量的组织和细胞(少至10个细胞)中进行RNA提取，本制品在裂解液中添加了特殊组分，可大幅度提高RNA和硅基质膜的选择性结合能力。同时，在RNA提取过程中，还加入RNase-Free DNase I，可去除痕量DNA杂质，而RNase-Free DNase I和其他残留的物质会在随后的漂洗过程中去除，从而有效地保证了提取RNA的得率和纯度。

与其它提取RNA的普通方法相比，本试剂盒将所有＜200bp的RNA(5.8S rRNA,5S rRNA和tRNAs等)选择性的筛除，而所有＞200bp的RNA则被富集、分离和纯化。提取的总RNA纯度极高，没有DNA和蛋白质污染。

从微量的样本中纯化得到的高质量的RNA，如显微切割得到的组织，纤维组织和细胞。
配有高效的DNase I，可有效去除DNA污染。
RNA纯度更高，无杂质残留，特别适合于对纯度要求很高的下游实验。
操作安全可靠，无需酚/氯仿抽提，无需氯化铯梯度离心，无需氯化锂或乙醇沉淀。

RT-PCR。
Northern Blot、Dot Blot。
Real-Time PCR。
芯片分析。
polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。

包装	组分	规格
包装一	裂解液RL	30mL
	去蛋白液RW1	40mL
	漂洗液RW	12mL
	Carrier RNA	310μg
	RNase-Free ddH2O	1mL
	RNase-Free ddH2O	2×15mL
	RNase-Free吸附柱CR1(含2mL收集管)	50套
	RNase-Free离心管(1.5mL)	50个
包装二	RNase-Free DNase I	1500U
	RDD缓冲液	4mL
	RNase-Free ddH2O	1mL

保存：包装一室温保存，包装二2～8℃保存，有效期1年。

选配试剂

蛋白酶K(货号：WH0236)、过滤柱CS

自备器材

β-巯基乙醇、无水乙醇、1.5mL RNase-Free离心管

特别说明

在本说明书中，对于不同的样品有不同的操作步骤，这些步骤的区别主要在于样品的裂解和结合至硅基质膜的条件不同，当RNA结合至硅基质膜后，后续步骤基本类似。

样品使用量的确定：为了使用本试剂盒得到高质量和高纯度的RNA，使用样品的量是否得当很重要，因为吸附柱的吸附量以及裂解液的用量有一定限制，只有保证样品充分的裂解及RNA充分吸附在硅基质膜上，RNA的得率才有保证。
表1：微量样品RNA提取试剂盒技术指标

最大吸附能力	45μg RNA
吸附柱最大容量	700μL
提取RNA的长度	＞200bp
最小洗脱体积	10μL
样品使用最大量(动物细胞)	5×10⁵
样品使用最大量(动物组织)	5mg

表2：不同培养条件下HeLa细胞的数量

细胞培养器皿	生长面积(cm2)	细胞数量
96孔细胞培养板	0.32～0.6	4～5×10⁴
48孔细胞培养板	1	1×10⁵
24孔细胞培养板	2	2.5×10⁵
12孔细胞培养板	4	5×10⁵
6孔细胞培养板	9.5	1×10⁶
平皿(35mm)	8	1×10⁶
摇瓶(40～50mL)	25	3×10⁶

样品的储存和处理：组织若不经过处理，其中的RNA处于无保护状态，容易被降解，所以新鲜组织应及时放入液氮中速冻并立即储存于-70℃，冻存的组织不能反复冻融以避免RNA的降解，样品液可以匀浆后加入裂解液RL，储存于-70℃，冻存的样品可稳定储存数月。
样品的裂解和均质：有效的裂解和均质是提取RNA的重要步骤，裂解和均质是两个不同的步骤。
- 裂解：将组织和细胞完全裂解，以彻底释放出样品中所有的RNA，不同的样品裂解的方法不同，如果样品裂解不彻底，将导致RNA得率低。
- 均质：均质的过程是为了降低细胞裂解后的溶液粘度，将高分子量的基因组DNA和其他物质切断，形成均一的溶液，利于RNA与硅基质膜的结合。如果均质过程未处理好，将影响RNA与硅基质膜的结合，从而导致RNA提取量低。均质的方法包括匀浆、涡旋震荡、过滤柱、注射器或枪头吸取等。
Carrier RNA：当处理＜10μg组织或＜5000个细胞时，可将试剂盒中提供的Carrier RNA加入裂解液中，实验证明，Carrier RNA的加入将提高RNA的得率，且不会影响后续实验。

为了防止RNA的降解，请避免未处理的样品在室温长时间放置，在组织固定前，RNA处于无保护状态，所以请将组织在液氮中速冻。
组织裂解液(在裂解液RL中)可在-70℃储存数月。处理冻存的裂解液时，可在室温或37℃水浴中将样品完全解冻，而且请注意裂解液中的盐需要完全溶解，之后立即进行后续操作。(长时间37℃处理将会导致RNA的化学降解)。
所有步骤在室温进行，为了尽量避免RNA的降解，操作越快越好。
在使用前，请用RNase-Free ddH2O配制乙醇溶液。
操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1mL RL中加入10μL β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RL可在4℃放置一个月，裂解液RL在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请加热溶解后使用。
第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。

DNase I储存液的配制：请小心打开装有DNase I的玻璃管盖子，以避免造成DNase I的损失，将DNase I干粉(1500U)溶解在550μL RNase-Free水中，轻柔地上下颠倒混匀DNase I溶液，不要涡旋振荡。
如需长时间保存DNase I溶液，请将玻璃瓶中的DNase I溶液进行分装，在-30~-15℃可保存9个月，DNase I溶液融化后可在2～8℃保存6周，溶解后的DNase I溶液不能再次冷冻。
Carrier RNA储存液的配制：在第一次使用Carrier RNA时，将Carrier RNA(310μg)溶解在1mL RNase-Free ddH2O中，将溶液分装后储存于-30~-15℃，此时该溶液的浓度为310μg/mL(310ng/μL)；该储存液应避免反复冻融，冻融次数不能超过3次。(当处理的细胞量小于5000个时，请在裂解液中加入Carrier RNA。)
Carrier RNA工作溶液的配制(以配制10次用量为例)：将5μL Carrier RNA储存溶液加入34μL裂解液RL中，用移液器混匀，将混匀后的溶液6μL加入54μL裂解液RL中，此时Carrier RNA终浓度为4ng/μL，取5μL终浓度为4ng/μL的Carrier RNA加入裂解液中。

一从微切割的冷冻样品中提取总RNA
以下的操作步骤适用于从冷冻的微切割动物组织中分离RNA。要从非常微量的样品中提取RNA是一项很有挑战性的工作，同时要注意，固定和处理样品的过程可能会对RNA完整性造成影响。

向样品中加入适量的裂解液RL(使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1%) (加入裂解液RL的体积与微切割仪器容积有关，但不能超过最大体积为(A) 65μL (B) 300μL。)
- (A)指的是微切割仪器Leica AS LMD系统可采用的体积，(B)指的是其他微切割系统可使用的裂解液体积，以下出现的(A) (B)与此一致。
如果需要，可将样品和裂解液RL转移至一个较大的1.5mL或2mL RNase-Free的离心管中(客户自备)。补充裂解液RL至体积为(A)75μL (B)350μL。
- (A) (B)所指的意义同步骤1，当处理的细胞量小于5000个时，向溶液中加入20ng Carrier RNA(5μL 4ng/μL Carrier RNA)，Carrier RNA溶液的配制请见“溶液配制”说明。
涡旋振荡30sec，使样品匀质化。
向样品中加入1倍体积((A)75μL (B)350μL)70%乙醇，用移液器混匀，立即进行第5步。
- 如果在匀质的过程中损失了一些裂解液，70%乙醇的加量也要相应减小。在加入乙醇后，溶液中可能会出现沉淀，但不会影响RNA的提取。
将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱CR1上(吸附柱CR1放在RNase-Free的2mL收集管中，该收集管试剂盒中已经备有)，轻柔地盖上管盖，12000rpm (~13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
向吸附柱CR1中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀。
向吸附柱CR1中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。
向吸附柱CR1中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
向吸附柱CR1中加入500μL漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
重复步骤10。
12000rpm(~13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
- 此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
将吸附柱CR1放入一个新的RNase-Free离心管(试剂盒中已备用)中，向膜中央加入14μL RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2min。12000rpm (~13400×g)离心1min，所得溶液即为RNA溶液。
- 洗脱体积不得少于10μL，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。

二、从福尔马林固定的微切割样品中提取总RNA
以下操作步骤适用于从福尔马林固定的微切割样品中提取总RNA。在从福尔马林固定的微切割样品中提取RNA时，主要的影响因素有：样品的新旧程度、固定的过程和样品的储存条件。RNA可能会降解成<300bp的片段，而本试剂盒能有效吸附>200bp的片段，所以如果样品中的RNA高度降解，可能会出现提不出RNA的情况。

预先加热水浴至55℃，为第4步中的蛋白酶K消化做准备。
向样品中加入适当体积的裂解液RL(使用前请向RL中加入β-巯基乙醇，终浓度1％)，加入裂解液RL体积与微切割仪器的容积有关，但不能超过140μL。
如果需要，可以将样品和裂解液RL转移至1.5mL或2mL的RNase-Free的离心管中(客户自备)。补充裂解液RL至体积为150μL。
- 当处理的细胞量小于5000时，向溶液中加入20ng Carrier RNA (5μL 4ng/μL Carrier RNA工作液)，Carrier RNA工作溶液的配制请见“溶液配制”说明。
向溶液中加入295μL RNase-Free ddH2O，然后加入5μL蛋白酶K溶液(浓度20mg/mL，客户自备)，用移液器混匀，55℃孵育10min。室温12000rpm (~13400×g)离心3min。
- 此时的组织碎片可能会形成小球，有时在溶液上面会浮有一层薄膜。
用移液器将上层溶液(450μL左右)转移至一个新的RNase-Free离心管中(客户自备)。
注意：使用移液器吸取上层溶液时，一定要避免接触到组织碎片小球，而且枪头要伸到薄膜以下进行吸取，避免将薄膜转移至离心管中。
向吸出的上层溶液中加入0.5倍体积的无水乙醇(通常为225μL)，用移液器混匀。
- 在加入乙醇后，溶液中可能会出现沉淀，但是不会影响RNA的提取。
将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱CR1上(吸附柱CR1放在2mL收集管中，此收集管试剂盒已经备有)，轻柔地盖上管盖，12000rpm (~13400×g)离心30～60sec，倒掉废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
向吸附柱CR1中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀。
向吸附柱CR1中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。
向吸附柱CR1中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
向吸附柱CR1中加入500μL漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
重复步骤12。
12000rpm(~13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
- 此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
将吸附柱CR1放入一个新的1.5mL RNase-Free离心管中(试剂盒中已备有)，向膜中央加入14μL RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2min。12000rpm (~13400×g)离心1min，所得溶液即为RNA溶液。
- 洗脱体积不得少于10μL，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。

三、从动物组织中提取总RNA
以下操作适用于从大多数动物组织中提取RNA，如果要从纤维组织中提取RNA，请看“四、从纤维组织中提取总RNA”。从动物组织中提取RNA，若要得到高纯度和高产量的RNA，组织的起始量非常重要，本试剂盒提供的吸附柱CR1最大结合能力为45μg，裂解液最多能裂解5mg的组织。有些组织像脾脏、部分脑组织、肺组织和胸腺组织在提取的过程中有可能会形成一些沉淀，但不会影响RNA的提取。推荐使用的组织量不超过5mg，请不要超过吸附柱CR1的载量，否则将会降低RNA的产量和纯度。

确定组织的总量，不要超过5mg，立即进行第2步。
在裂解液RL(使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1％)中将组织块切碎和匀浆(请见步骤2a，2b)
- 组织块的切碎和匀浆过程可采用下列a和b两种方法之一，当处理小于10μg的组织时，需要向裂解液中加入20ng Carrier RNA工作溶液(5μL 4ng/μL)，Carrier RNA工作溶液的配制请见“溶液配制”说明。匀浆不彻底将导致RNA提取量低，还可能导致堵塞吸附柱CR11的现象发生。
- 使用匀浆器进行匀浆：
  将称重过的组织块放在一个大小合适的容器中，加入350μL裂解液RL，立即进行匀浆至均一溶液(通常时间为20～40sec)，继续步骤3。
- 使用研磨杵(客户自备)进行研磨：在1.5mL RNase-Free的离心管中(客户自备)加入350μL裂解液RL，将组织块迅速从-80℃转入这个离心管中，用研磨杵充分研磨，彻底将组织破碎，注意避免组织冻融。将此溶液移至过滤柱CS(客户自备)上(过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm (~13400×g)离心2min，收集滤液，继续步骤3。
将匀浆好的样品(2a)或者过滤液(2b)以12000rpm (~13400×g)离心3min，用移液器仔细将上清液转移到新的1.5mL RNase-Free离心管中(客户自备)。
向上清中加入1倍体积(350μL)70%乙醇，用移液器混匀，立即进行第5步。
- 如果在以上过程中损失了一些裂解液，70%乙醇的加量也要相应减小。在乙醇加入后，溶液中可能会出现沉淀，但不会影响RNA的提取。
将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱CR1上(吸附柱CR1放在2mL收集管中，试剂盒中已备有)，轻柔地盖上管盖，12000rpm (~13400×g)离心30～60sec，倒掉废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
向吸附柱CR1中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀。
向吸附柱CR1中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。
向吸附柱CR1中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
向吸附柱CR1中加入500μL漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
重复步骤10。
12000rpm(~13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
- 此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
将吸附柱CR1放入一个新的RNase-Free离心管中(试剂盒中已备有)，向膜中央加入14μL RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2min。12000rpm (~13400×g)离心1min，所得溶液即为RNA溶液。
- 洗脱体积不得少于10μL，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。

四、从纤维组织中提取总RNA
纤维组织，例如骨骼肌、心脏、皮肤中含有大量的收缩蛋白、连接组织和胶原质，只有去除这些蛋白质，才能使RNA的提取顺利进行。所以在从纤维组织中提取总RNA时，引入了蛋白酶K消化这一过程。
采用以下操作，可成功地从心脏、肌肉和皮肤组织中提取RNA，其他富含蛋白质的组织也可采用此方法进行RNA的提取，值得注意的是，在进行蛋白酶K消化过程中的缓冲液不能对RNase进行长期有效的抑制，因而此方法不适用于含有丰富RNase的脾脏和肠组织等RNA的提取。
推荐使用的组织量不超过5mg，请不要超过吸附柱CR1的载量，否则将会降低RNA的产量和纯度。

预先加热水浴至55℃，为第4步中的蛋白酶K消化做准备。
确定组织的总量，不要超过5mg，立即进行第3步。
在裂解液RL(使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1％)中将组织块匀浆(3a)或者研碎(3b)。
当处理小于10μg的组织时，需要向裂解液中加入20ng Carrier RNA工作液(5μL 4ng/μL溶液)，Carrier RNA溶液的配制请见“溶液配制”说明。匀浆不彻底会导致RNA提取量低，还可能导致吸附柱CR1堵塞。采用匀浆器或过滤柱进行匀浆，会比采用其他方式匀浆获得更高的RNA得率。
- 使用匀浆器进行匀浆：将称重过的组织块放在一个大小合适的容器中，加入150μL裂解液RL，立即进行匀浆至均一溶液(通常时间为20～40sec)，继续步骤4。
- 使用研磨杵(客户自备)进行研磨：在1.5mL RNase-Free的离心管中(客户自备)加入150μL裂解液RL，将组织块迅速从-80℃转入这个离心管中，用研磨杵充分研磨，彻底将组织研碎，注意避免组织冻融，继续步骤4。
  - 当使用研磨杵研磨时，请务必将组织彻底研碎，以保证裂解充分。
向溶液中加入295μL RNase-Free ddH2O，然后加入5μL蛋白酶K溶液(浓度为20mg/mL，客户自备)，用移液器混匀。55℃孵育10min。室温12000rpm (~13400×g)离心3min。
- 此时的组织碎片可能会形成小球，有时在溶液上面会浮有一层薄膜。
用移液器将上层溶液(通常450μL左右)转移至一个新的1.5mL RNase-Free的离心管中(客户自备)。
- 使用移液器吸取上层溶液时，一定要避免接触到组织碎片小球，而且枪头要伸到薄膜以下进行吸取，避免将薄膜转移至离心管中。
向吸出的上层溶液加入0.5倍体积的无水乙醇(通常为225μL)，用移液器混匀。
- 在乙醇加入后，溶液中可能会出现沉淀，但是不会影响RNA的提取。
将所有溶液及沉淀物质全部转移至吸附柱CR1上(吸附柱CR1放在2mL收集管中，试剂盒已经备有)，轻柔地盖上管子，12000rpm (~13400×g)离心30～60sec，倒掉废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
向吸附柱CR1中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀。
向吸附柱CR1中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。
向吸附柱CR1中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
向吸附柱CR1中加入500μL漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
重复步骤12。
12000rpm(~13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
- 此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
附柱CR1放入一个新的RNase-Free离心管(试剂盒中已备用)中，向膜中央加入14μL RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2min。12000rpm (~13400×g)离心1min，所得溶液即为RNA溶液。
- 洗脱体积不得少于10μL，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。

五、从动物细胞中提取总RNA
从动物细胞中提取RNA，若要得到高纯度和最佳产量的RNA，细胞的起始量非常重要，本试剂盒提供的吸附柱CR1最大结合能力为45μg，而裂解液最多能裂解5×10⁵的细胞。推荐使用的细胞量不超过5×10⁵，请不要超过吸附柱CR1的载量，否则将会降低RNA的产量和纯度。

细胞的处理和裂解
- 细胞沉淀：轻弹管底使细胞分开，加入350μL裂解液RL(使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1%)，涡旋振荡或用移液器混匀，继续步骤2。
- 悬浮培养细胞：确定细胞的数量(见表2)，在RNase-Free的离心管(客户自备)中300×g离心5min沉淀细胞，去除所有上清，加入350μL裂解液RL(使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1%)，继续步骤2。
- 单层贴壁细胞：对于该种细胞的收集可直接在细胞培养器皿中进行(直径最大为10cm)，或者可以先用胰蛋白酶消化，再收集细胞沉淀，进行裂解。
  - 直接在细胞培养器皿中进行裂解：
    确定细胞数量，将细胞培养基完全吸出，加入350μL裂解液RL(使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1%)裂解细胞，收集细胞裂解液并将其转移至1.5mL RNase-Free离心管(客户自备)中，涡旋振荡或用移液器混匀，确保看不见任何成团的细胞之后，继续步骤2。
  - 胰蛋白酶消化(摇瓶中培养的单层贴壁细胞，通常采用胰蛋白酶消化的方法)：
    确定细胞数量，吸出培养基，用PBS缓冲液洗细胞，吸除PBS缓冲液，加入含有0.10～0.25%胰蛋白酶的PBS缓冲液处理细胞，在细胞脱离容器壁后，加入含有血清的溶液使胰蛋白酶失活，将细胞转移到RNase-Free的离心管中，300×g离心5min沉淀细胞，仔细去除所有上清。加入350μL裂解液RL(使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度1%)裂解细胞。继续步骤2。
- 如果细胞培养基没有去除干净，将会稀释裂解液，影响裂解效果及RNA与硅胶树脂膜的结合，这将导致RNA的提取量降低。
- 当处理的细胞量≤1×10⁵时，裂解液RL的加量可以减少至75μL，这时可采用小一些的离心管，涡旋振荡1min使裂解液匀质化，进行步骤3。
- 如果处理细胞量<5000时，需要向裂解液中加入20ng Carrier RNA (5μL 4ng/μL溶液)，Carrier RNA溶液的配制请见“溶液配制”说明。
- 如果细胞重悬不完全，将会导致裂解不充分，降低RNA的产率。
样品的匀质化(请见步骤2a，2b)
- 匀质不彻底将导致RNA提取量低，还可能导致吸附柱CR1堵塞，采用匀浆器或过滤柱进行匀质，会比采用其他方式匀浆获得更高的RNA得率。
- 将加入裂解液的细胞转移至过滤柱CS(客户自备)上(过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm (~13400×g)离心2min，收集滤液，继续步骤3。
- 使用匀浆器匀浆30sec。
加入1倍体积(通常为350μL)70%乙醇，用移液器混匀，立即进行第4步。
- 如果在匀质的过程中损失了一些裂解液，70%乙醇的加量也要相应减小。如果在第2步中只加入了75μL的裂解液RL，则在本步骤中也只需加入75μL的70%乙醇，加入乙醇后，溶液中可能会出现沉淀，但是不会影响RNA的提取。
将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱CR1上(吸附柱CR1放在2mL RNase-Free的收集管中，此收集管试剂盒中已经备有)，轻柔地盖上管盖，12000rpm (~13400×g)离心30～60sec，弃废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
向吸附柱CR1中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀。
向吸附柱CR1中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。
向吸附柱CR1中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
向吸附柱CR1中加入500μL漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm(~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
重复步骤9。
12000rpm(~13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
- 此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
将吸附柱CR1放入一个新的RNase-Free离心管(本试剂盒中已经备有)中，向膜中央加入14μL RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2min。12000rpm (~13400×g)离心1min，所得溶液即为RNA溶液。
- 洗脱体积不得少于10μL，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。

产品目录